Se vogliamo parlare in
linea generale di flora microbica intestinale utile penso ci si riferisca a: Bifidobatteri, Lactobacilli, Bacteroidi
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La microflora intestinale dei caniLa popolazione batterica con i suoi processi biochimici, influenza molti aspetti della fisiopatologia dell’ospite, dalla digestione alla difesa nei confronti di agenti patogeni; al punto che alcuni autori hanno parlato di un vero e proprio organo metaboliAntonietta Guglielmelli
Dipartimento di Scienze Zootecniche e Ispezione degli alimenti, Sez. B. Ferrara
Università degli Studi di Napoli “Federico II”
La microflora intestinale è un insieme di microrganismi presenti nel lume intestinale i quali, se convivono nel giusto equilibrio contribuiscono allo stato di salute dell’ospite.
I microrganismi intestinali vivono una relazione simbiotica con le cellule eucariote della mucosa, beneficiando del costante flusso di nutrienti, della temperatura stabile e delle nicchie offerte dall’ambiente intestinale che garantiscono la copertura delle diverse esigenze metaboliche.
Dall’altra parte l’ospite, beneficia di diverse capacità dei batteri, quali:
• sintetisi di vitamina K;
• effetti trofici sulle cellule epiteliali intestinali;
• inibizione della crescita di patogeni;
• sostegno dell’integrità della barriera intestinale
• mantenimento dell’omeostasi intestinale;
• produzione di energia a partire dagli acidi grassi volatili a corta catena (SCFA).
In particolare, gli SCFA prodotti dalle fermentazioni vengono rapidamente assorbiti (Stevens, 1978), e forniscono energia metabolizzabile all’ospite. Gli SCFA e molti altri metaboliti dei batteri inibiscono la crescita di patogeni e dei batteri responsabili dei processi putrefattivi (Gibson e Wang, 1994).
Alcuni studi hanno dimostrato che i microrganismi intestinali modulano l’espressione genica intestinale, interessando il trasporto dei nutrienti, il metabolismo dei lipidi e i sistemi di detossificazione (Hopper e Gordon, 2001).
I batteri influenzano la struttura e le funzioni della mucosa nel piccolo intestino (Batt e McLean, 1987) con specifiche differenze tra forme aerobie e anaerobie.
La presenza di batteri nell’intestino è talmente importante per lo sviluppo di diverse funzioni fisiologiche che animali germ-free (fatti nascere e mantenuti in un ambiente totalmente sterile, che, quindi, non sviluppano microflora intestinale) presentano inevitabilmente alterazioni della struttura e delle funzioni intestinali con un appiattimento dei villi, cripte intestinali poco profonde, basso numero di leucociti, riduzione del numero e della consistenza delle placche di Peyer con conseguente diminuzione dell’attività immunitaria locale.
Si comprende quindi che la presenza di una corretta microflora a livello intestinale è un requisito necessario sia per lo sviluppo delle funzioni di digestione e assorbimento dei nutrienti a livello intestinale, sia per consentire il corretto funzionamento del sistema immunitario sistemico.
Sviluppo della popolazione microbica
Lo sviluppo della microflora comincia alla nascita, quando il neonato, il cui tratto gastro-intestinale è ancora sterile, attraversa il canale del parto venendo a contatto con i microrganismi del tratto uro-genitale della madre. Dopo solo 24 ore dalla nascita la quantità di batteri reperibile nell’intestino del neonato è comparabile a quella di un animale adulto e, sebbene la densità rimanga stabile in tutte le fasi di sviluppo, si realizzano delle modificazioni nelle proporzioni relative ai differenti gruppi batterici. Inizialmente le forme aerotolleranti dominano nell’intestino crasso, ma nei giorni che seguono la nascita sono largamente rimpiazzate da quelle anaerobie (Randal e Buddington, 1998).
Lo sviluppo della popolazione batterica colonizza l’intestino del cane in maniera molto simile a quanto avvine nell’uomo; inizialmente si tratta di colonie di derivazione materna che proliferano, trovando beneficio con l’allattamento, durante lo svezzamento la tendenza si sposta drasticamente nella direzione degli anaerobi obbligati aumentando con il consumo dei alimenti solidi (Benno et al., 1992 a). Durante l’allattamento possono essere isolati dalle feci bifidobatteri, lactobacilli e clostridi, che vengono gradualmente soppiantati da altri microrganismi quali ad esempio i bacteroidi (Randal e Buddington, 1998).
Nei Beagles, le colonie più numerose, durante il primo anno di vita, sonoBacteroides, Bifidobacteria, Lactobacilusi e cocchi anaerobi, mentre clostridi e streptococchi aumentano successivamente (Benno et al., 1992a). Gli stessi autori in un secondo lavoro confrontando le popolazioni microbiche presenti nei diversi tratti del digerente in due gruppi di Beagles, il primo costituito da cani di età inferiore ai12 mesi e l’altro da soggetti di età superiore agli 11 anni, non hanno riscontrato differenze rilevanti tra i due gruppi relativamente alla microflora presente a livello gastrico e nei diversi tratti dell’intestino tenue, mentre in tutte le regioni dell’intestino crasso (cieco, colon e retto) i soggetti anziani hanno mostrato livelli di batteroidi, eubatteri, peptostreptococchi, bifidobatteri, lattobacilli e stafilococchi più bassi rispetto a quelli giovani. Di contro la presenza di Clostridium perfringens e streptococchi è risultata più consistente nei soggetti anziani. I risultati di questo studio dimostrano quindi che l’avanzare dell’età comporta alcuni cambiamenti nella composizione microbica dell’intestino crasso (Benno et al., 1992b).
I cambiamenti legati all’età, possono essere attribuiti al cambiamento dei costituenti della dieta, in particolare durante lo svezzamento. È noto, infatti, che le caratteristiche chimico-nutrizionali del latte favoriscono la proliferazione dei bifidobacteri, quindi dopo lo svezzamento, quando il latte non è più disponibile, la densità di tali microrganismi si riduce.
Le variazioni dell’ecologia microbica dell’ intestino crasso hanno una grossa influenza sulla salute dei cani (Buttin e Sergheraert, 1993). Una grossa importanza hanno le relazioni tra dieta, funzioni digestive, microflora e salute, tali interferenze sono più influenti nelle prime fasi dello sviluppo, quando la microflora è instabile e non sono state ancora acquisite le funzioni digestive dell’animale adulto. Inoltre, alcuni problemi possono essere associati anche a un declino della funzionalità digestiva associata alla senescenza.
Composizione della microflora intestinale
La normale microflora intestinale è composta da batteri aerobi, anaerobi e anaerobi facoltativi. La percentuale di aerotolleranza declina procedendo distalmente e nel colon dove oltre il 99% dei batteri è anaerobia.
La composizione della dieta influenza la concentrazione dei batteri nel tratto gastrointestinale; diete con alti contenuti in proteine possono favorire la crescita di batteri proteolitici, specialmente clostridi, mentre alcuni tipi di fibre fermentescibili stimolano lo sviluppo di batteri che utilizzano gli zuccheri, quali bifidobatteri e lattobacilli.
Per poter colonizzare l’intestino i microrganismi devono possedere due proprietà importanti: capacità di aderenza e di sopravvivenza; quest’ultima viene assicurata dalla produzione di enzimi e tossine e dall’abilità di catturare il ferro. Avendo poi ciascuno un diverso metabolismo la convivenza tra i diversi gruppi batterici è possibile grazie al controllo che ciascuna specie esercita sullo sviluppo dell’altra.
I principali gruppi di batteri più comunemente ritrovati nell’uomo e nel cane, includono clostridi, batterioidi, streptococchi, coliformi, enterococchi, lattobacilli e veillonella (Smith., 1965; Greetham et al., 2002; Buddington 2003; Rinkinen et al, 2004).
La popolazione batterica aumenta quantitativamente dal duodeno al colon ed è regolata da diversi fattori, endogeni ed esogeni, come: la motilità intestinale, la disponibilità del substrato, le secrezioni batteriostatiche e battericide, quali ad esempio gli acidi gastrici, la bile e le secrezioni pancreatiche (German e Zantek, 2006).
Gli acidi biliari hanno effetti differenti sulle varie specie di microrganismi e sono per questo usati in alcuni terreni selettivi. È possibile che l’assenza dell’attività di assorbimento e l’abbassamento del riciclo enteropatico di acidi biliari durante la lattazione sia un meccanismo adattativo che permette agli acidi biliari di entrare nel colon e in tal modo favorire la crescita di gruppi tolleranti, come i bifidobatteri. Allo stesso modo, i batterioidi, che sono acido sensibili, non crescono in abbondanza fino al periodo successivo allo svezzamento, comincia l’assorbimento degli acidi biliari e può essere ridotta la concentrazione acida nel colon. È da considerare inoltre la competitiva e sinergica relazione che esiste tra i differenti gruppi di batteri.
L’intestino crasso contiene un complesso sistema di microrganismi comprendenti molti generi e alcune centinaia di specie batteriche.
Molti batteri sono anaerobi, Streptocuccus, Lactobacillus, Bacteroides e Clostridium (Maskell e Johnson, 1993).
I batteri del colon fermentano i nutrienti della dieta e le secrezioni endogene che sfuggono dalla digestione e dall’assorbimento nell’intestino tenue, tra questi polisaccaridi non amidacei, zuccheri non assorbiti, oligosaccaridi, proteine alimentari, enzimi endogeni. La porzione prossimale del colon umano generalmente è ricca di carboidrati, mentre le fermentazioni proteiche prevalgono nel colon distale (Macfarlane et al., 1992). Tale situazione è probabilmente la stessa nel cane e nel gatto.
I prodotti finali delle fermentazioni batteriche e del metabolismo sono acidi grassi a corta catena (acetato, propinato e butirrato), lattato, anidride carbonica e idrogeno. Altri prodotti delle fermentazioni includono metano, ammoniaca, acidi grassi a catena ramificata, ammine, fenoli e indoli. Le proporzioni relative di questi composti è influenzata dalla composizione della microflora del colon, dalle interazioni tra le diverse quantità di batteri, dalla disponibilità dei nutrienti, dal tempo di transito intestinale e da una varietà di fattori legati all’ospite, quali età, stato immunitario e fattori genetici (Cumming e Macfarlane, 1991).
Gli acidi grassi a catena corta forniscono energia alle cellule dell’intestino crasso; nei cani i colonociti ossidano il butirrato in quantità maggiore rispetto al glucosio, ciò fa del butirrato il principale combustibile delle cellule intestinali.
I batteri influenzano inoltre la struttura della mucosa e le sue funzioni (Buddington et al., 2000). La produzione degli SCFA come risultato delle fermentazioni endogene e dei nutrienti stimolano l’assorbimento dell’acqua e degli elettroliti e, talvolta, sono coinvolti nelle funzioni di regolazione osmotica del tratto gastro-intestinale (Stevens e Hume, 1995).
Gli SCFA possono favorire la proliferazione dei colonociti e degli enterociti oltre a stimolare la crescita della mucosa. Il butirrato risulta essere l’acido grasso più importante a tale scopo, mentre il propinato quello meno coinvolto. Di conseguenza si può affermare che l’impatto dei batteri sul tratto gastro-intestinale dipende dalla relativa proporzione dei acidi grassi a corta catena prodotti.
Una relazione simbiotica appare esistere tra batteri aderenti e la mucosa (Buddington et al., 2000).
Tali batteri influenzano l’endocitosi e la capacità idrolitica intracellulare della mucosa e, conseguentemente, giocano un ruolo nella degradazione dei potenziali antigeni presenti nel lume intestinale. Questo è importante per la regolazione del sistema immunitario enterico in quanto aumenta l’antigenicità di numerose macromolecole presenti nell’intestino. Infine occorre considerare l’aumento della produzione di immunoglobulina A secreta.
La velocità di transito intestinale gioca un ruolo nella determinazione della microflora del colon. Cumming e Macfarlane, 1991 riportano un aumento della velocità di transito correlato con l’aumento della concentrazione dei prodotti finali della fermentazione delle proteine (ammoniaca e fenoli).
Gibson e Roberfroid (1995) dimostrano che la maggior parte dei batteri intestinali possono essere divisi in specie che esercitano degli effetti dannosi (stafilococchi, clostridi e veillonella) o specie che danno benefici all’ospite (bifidobatteri, lattobacilli ed eubatteria). Diarrea, infezioni e promozione di carcinogenesi sono esempi di effetti patogeni; mentre difesa contro i patogeni e prevenzione di infezioni sono esempi di effetti benefici (Gibson e Wang, 1994; Araja-Kojima et al., 1995).
Il maggior metodo per modificare la popolazione batterica del colon è l’intervento sui substrati fermentativi forniti; tra i quali l’utilizzo di prebiotici che stimolano selettivamente la crescita dei batteri, per esempio favorendo la crescita di bifidobatteri e lattobacilli a discapito di Clostridium perfringens.
Uso delle tecniche molecolari per lo studio della microflora del tratto gastrointestinale del cane
Un ostacolo significativo allo studio della microflora intestinale è rappresentato dalla difficoltà di identificare e quantificare effettivamente le specie microbiche. Come dimostrato alcune ricerche, i metodi classici di coltura microbiologica, non solo sono laboriosi e dispendiosi in termini di tempo, ma sono a volte anche poco accurati (Greetham et al., 2002). In quanto, data la difficoltà di coltivare queste specie batteriche in vitro, la loro identificazione di specie o genere è difficoltosa se non addirittura impossibile. Tuttavia esistono tecniche come quelle basate sulla ricerca del DNA, che consentono di evitare tali tecniche.
Il “National Human Genome Research Institute of National Insitute of Health” ha condotto studi relativi alla decifrazione del codice genetico umano e ha incluso i genomi di vari modelli animali.
Sono stati sequenziati non solo i genomi del cane e del gatto (http://www.genome.gov/12514461), ma anche quelli di numerosi ceppi batterici importanti, per la salute intestinale. Esistono quindi i genomi completi di:Bacterioides (Xu et al., 2003), Lactobacillus (Pridmore et al., 2004; Alterman et al., 2005), Bifidobacterium (Schell et al., 2002), Clostridium (Shimizu et al., 2002),Enterococcus (Paulsen et al., 2003) ed E. coli (Blattner et al., 1997).
Sebbene il sequenziamento del genoma sia solamente il primo passo per la comprensione del metabolismo microbico, tali dati possono essere usati subito per mostrare i potenziali benefici (per esempio immuno-modulazione; patogeno resistenza) o minacce (per esempio la produzione di tossine) di specie microbiche specifiche e dell’identificazione del bersaglio della loro attività.
Tecniche molecolari basate sull’identificazione del 16S rRNA o 16S ribosomal DNA (DNA codificante il 16S rRNA) hanno consentito l’identificazione di un grosso numero di specie batteriche.
Un gene 16S rRNA batterico ha in media una lunghezza di circa 1,500 nucleotidi e contiene regioni con differenti gradi di variabilità, consentendo di distinguere organismi a differenti livelli filogenetici (Namsolleck et al., 2004). Alcune tecniche molecolari basate sulla sequenza rDNA 16S, come l’ibridazione in-situ con sonde fluorescenti (FISH), l’elettroforesi su gel in gradiente denaturante (DGGE), il dot blot quantitativo, i polimorfismi di restrizione (RFLP), possono essere usate per superare alcune delle limitazioni delle tecniche colturali.
Dati gli sviluppi recenti della biologia molecolare i metodi basati sul DNA possono essere utilizzati a completamento delle tecniche esistenti. Un’ulteriore identificazione e caratterizzazione della popolazione batterica canina non sarà solo usata nella valutazione degli effetti della dieta sulla salute intestinale, ma sarà implicata anche nella valutazione più generale dello stato di salute dell’animale.
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7 Febbraio 2009[/size][/font][/size][/color]
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